恶臭假单胞工程菌作为“活性”群体淬灭剂用于生物膜控制，苯系物降解及其环境风险评估
题目：Engineering a Pseudomonas Putida as living quorum quencher for biofilm formation inhibition, benzenes degradation, and environmental risk evaluation
第一作者：薛怡梅（xueyimei1998@126.com）
通讯作者：王灿（wangcan@tju.edu.cn）
通讯单位：天津大学
DOI：https://doi.org/10.1016/j.watres.2023.120690
期刊名称：Water Research
图文摘要
文章亮点
（1）成功构建了具有群体淬灭功能的工程假单胞菌
（2）假单胞工程菌同时具备生物膜控制与苯系物降解功能
（3）假单胞工程菌在实际污泥中的环境风险可控
文章摘要
通过群体感应淬灭(QQ)干扰细菌之间的通讯及联系已被证明在生物膜形成及污染控制方面具有应用潜力。然而，若能将QQ与污染物高效降解相结合，会更适用于实际环境应用场景。本研究通过对恶臭假单胞菌进行改造，在恶臭假单胞菌中引入QQ酶合成基因，使得改造后的工程淬灭菌既能抑制生物膜的形成，又能高效降解废水中苯系污染物。转入的群体淬灭酶控制基因aiiO在假单胞工程菌中表达良好，产生的QQ酶有效的降解了信号分子(AHLs)。该假单胞工程菌的投加降低了活性污泥中AHLs浓度，群体感应基因表达水平以及群体感应相关菌属的分子生态网络连接，从而抑制了生物膜的形成。同时，苯甲酸钠降解实验结果表示，投加假单胞工程菌对污泥中苯甲酸钠污染物的去除能力增强。此外，假单胞工程菌丰度监测与基因水平转移实验证明了投加假单胞工程菌的环境风险可控。综上所述，本研究结果为通过基因工程手段解决复杂实际环境问题提供了可选策略，并为多功能工程菌在解决环境问题中的应用提供了支持。
图文总结
图1 群体淬灭工程菌(KT-PR-aiiO)
的构建及其功能验证。
(a) 选择群体淬灭酶分泌基因aiiO作为目的基因，以恶臭假单胞菌KT2440为底盘菌，构建工程淬灭菌。(b) 工程菌KT-PR-aiiO对不同类型AHL的淬灭能力。以典型的群体淬灭菌Rhodococcus BH4作对比。(c) 添加工程菌20 h后活性污泥中aiiO基因丰度监测。对照组不添加假单胞工程菌。基因丰度采用对数处理(Lg)。经t检验，差异有显著性(* p < 0.05， ** p < 0.01， ** p < 0.001)。
图2 工程菌KT-PR-aiiO的对活性污泥的影响
(生物膜形成、微生物群落和苯系物降解)。
(a) KT2440、Rhodococcus BH4和KT-PR-aiiO组的生物膜形成情况。小图显示了基于线性拟合的不同组的生物膜形成速率。(b) 空白对照、KT2440、Rhodococcus BH4、KT-PR-aiiO组活性污泥对AHLs的淬灭能力。小图显示了基于线性拟合的AHLs在不同组的淬灭速率。(c) 空白对照、KT2440、Rhodococcus BH4和KT-PR-aiiO组对苯甲酸钠的降解情况。(d) 使用CLSM观察KT2440(左)、Rhodococcus BH4(中)和KT-PR-aiiO(右)组载体表面的生物膜。绿色和红色分别表示活的和死的微生物细胞。经t检验，差异有显著性(* p < 0.05， ** p < 0.01， ** p < 0.001)。
图3 KT-PR-aiiO对活性污泥的影响
(微生物群落特征)。
(a) 对照和KT-PR-aiiO组群体感应相关菌属的分子生态网络。(b)基于Bray-Curtis距离的PCoA分析显示的对照组和KT-PR-aiiO组微生物群落的差异。(c)对照组和KT-PR-aiiO组生物膜样品中具有显著差异的群体感应相关基因及丰度。
图4 添加假单胞工程菌对生物膜形成抑制的基因水平
机理示意图(红色表示相对丰度下调的基因)。
图5 投加KT-PR-aiiO的环境风险评估。
(a)活性污泥群落中KT-PR-aiiO菌落数的比例随时间的演替。小图表示活性污泥群落中KT-PR-aiiO丰度(CFU/mL污泥)随时间的变化。采用LB双抗性平板(浓度为25 μg/mL氯霉素和50 μg/mL卡那霉素)筛选KT-PR-aiiO。(b) aiiO基因在活性污泥群落中(16S基因结果)的比例随时间的演替。小图表示活性污泥群落中aiiO基因丰度(拷贝数/mL污泥)随时间的变化。(c) 基因水平转移(HGT)实验，以KT-PR-aiiO为供体菌株，大肠杆菌GMCC 10667为受体菌株，评估工程菌外源基因(aiiO)在环境中水平转移的风险。
文章结论
本研究成功构建了具有较强群体淬灭能力的工程QQ细菌P.putida KT2440-pBBR-aiiO。结果表明，假单胞工程菌的投加有效降低了活性污泥的生物膜形成量和信号分子浓度。投加假单胞工程菌组的污泥也表现出较强的苯甲酸钠降解能力。同时，微生物群落结果显示，随着工程QQ菌的加入，QS通路中功能基因的相对丰度降低，QS属的连接减弱。此外，通过丰度监测和HGT实验评估假单胞工程菌的环境风险。随着时间的推移，假单胞工程细菌和aiiO基因的绝对丰度显著下降，假单胞工程细菌的质粒几乎没有转移到受体菌株中，这可能更符合实际需要，因为假单胞工程菌是可控的。在实际应用中，可对生物反应器中的假单胞工程菌进行监测和定期补充。