基于石墨烯生物传感器直接、超快速、灵敏检测环境病原微生物
第一作者：杜漫漫（天津大学，军事科学院）
其他作者：马金标，张志伟，伍光祖，吴建国，王浩
通讯作者：谢新武（军事科学院），王灿（天津大学）
DOI：10.1016/j.aca.2023.341810
期刊：Analytica Chimica Acta
图文摘要
环境中的病原微生物对全球人类健康构成严重威胁。本研究开发了一种基于还原氧化石墨烯（rGO）-场效应晶体管（FET）生物传感器，以实现病原微生物的快速、灵敏检测。采用原位热还原法制备rGO-FET传感器，并使用交联剂固定生物识别元件，实现rGO的表面功能化。rGO-FET生物传感器可以在46 s内检测的大肠杆菌O157:H7低至1.4 CFU mL−1。归一化电流响应与大肠杆菌浓度在1.4–1.4 × 107 CFU mL−1范围内呈线性相关。大肠杆菌O157:H7的归一化电流响应比其他微生物高一个数量级左右，表明该生物传感器具有良好的特异性。未修饰的rGO-FET传感器和用抗大肠杆菌O157:H7抗体修饰的rGO-FET生物传感器在4°C储存30天后的电流损失率分别约为8%和15%。最重要的是，rGO-FET生物传感器可以直接检测真实环境样品，无需预处理。与其他技术相比，rGO-FET生物传感器可以在更短的时间内检测出更宽的线性范围的病原微生物，这对于环境中病原微生物的快速预警和控制具有重要意义。
研究背景
环境中存在许多病原微生物，并通过空气、水、土壤和其他环境介质传播。大肠杆菌O157:H7是大肠杆菌的主要致病菌株，主要通过水和食物传播。摄入10-100个大肠杆菌O157:H7细胞可导致呼吸衰竭、癫痫、胃肠道疾病、肾衰竭、贫血、溶血性尿毒症综合征、出血性结肠炎和急性肾衰竭，最终导致死亡，尤其是婴儿和免疫功能低下的个体。这些病原微生物在环境中的广泛传播无疑将对人类健康和公共安全构成严重威胁。因此，环境病原微生物的监测和预警显得尤为重要。然而，真实的环境样本往往是复杂多样的。传统检测方法在分析前需要进行富集、纯化等预处理步骤，操作繁琐、耗时，对仪器和人员要求高，且不适合现场检测。FET生物传感器具有灵敏度高、响应快、免标记、操作简单、小型化、集成化等特点，非常适合病原微生物的检测。作为一种二维纳米材料，石墨烯具有大比表面积，为负载大量生物分子提供较大的有效反应面积；理想的载流子迁移率（200000 cm2 v−1 s−1），可实现快速电子传输；易于表面功能化，有利于生物识别元件的固定化，实现其高选择性。功能性石墨烯可以与DNA、酶、蛋白质、抗原、抗体等特定分子结合。目前，石墨烯FET生物传感器可用于检测颗粒、小分子、核酸和蛋白质等小生物分子。然而，真实环境样品中目标物的浓度非常低，检测前往往需要浓缩、细胞裂解或DNA提取等步骤。目前，已报道的检测方法往往旨在分析人工样品或模拟环境样品。因此，本研究开发了一种rGO-FET生物传感器，用于直接、快速、灵敏地检测真实环境样品中的病原微生物。
文章亮点
1、原位热还原法制备rGO-FET传感器。
2、rGO-FET生物传感器可以在46 s内检测到1.4 CFU mL−1的大肠杆菌。
3、rGO-FET生物传感器具有良好的特异性和稳定性。
4、rGO-FET生物传感器无需预处理即可直接检测真实样品。
图文总结
将GO悬浮液滴涂到硅基叉指电极上，将电极置于管式炉中进行原位热还原。使用1-芘丁酸N-羟基琥珀酰亚胺酯作为交联剂，将抗大肠杆菌O157:H7抗体固定在电极表面。使用TBS封闭缓冲液封闭，防止非特异性吸附，得到生物功能化的rGO-FET生物传感器，检测样品中的大肠杆菌O157:H7。
图2 rGO-FET传感器的表征
(a)裸电极的AFM图像。(b)具有rGO的电极的AFM图像。(c) GO（黑线）和rGO（红线）的拉曼光谱。(d) GO和rGO的XPS谱。(e) GO的C1s XPS谱。(f) rGO 的C1s XPS谱。
AFM图像显示与裸电极（图2a）相比，热还原后的电极表面被rGO覆盖。如图2b所示，rGO纳米片的厚度为1-5 nm（RMS = 3.37 nm）。图2c拉曼光谱中ID/IG从0.97 (GO)增加到1.02 (rGO)，表明GO成功还原为rGO。还原后532 eV处的O1s峰代表的GO氧含量显着降低，284 eV处的C1s峰代表的碳含量在还原后明显增加（图2d）。图2e显示GO的C1s XPS谱主要由C-C、C-O和C=O组成，具有饱和的sp3键。还原后，C-C键变得比其他与氧有关的键强得多，并且出现了更大的sp2键（图2f），这也证明了GO成功还原为rGO。
图3 rGO-FET 生物传感器功能化过程的表征
(a)表面功能化过程的Ids-Vds曲线 (Vgs = 0.3 V)。(b)表面功能化过程的Ids-Vgs曲线 (Vds = 0.01 V)。(c) rGO-FET生物传感器的表面功能化过程及接触角变化。
随着表面功能化的过程，Ids和Dirac点位置发生变化（图3a和b）。转移特性曲线显示rGO-FET生物传感器具有明显的双极性特征（图3b），表明功能化过程是成功的。经计算表面电极上的抗大肠杆菌 O157:H7抗体的密度约为1.36 × 107 M−1 cm−1。对生物传感器的亲水性进行表征（图3c），GO在叉指电极上热还原后亲水角增大，但随着表面功能化的进行逐渐减小。结果表明，不同官能团与生物大分子的结合可以改变rGO-FET生物传感器的表面亲水性，有利于目标的识别和检测，也证明了rGO-FET生物传感器的表面功能化过程是成功的。
图4 rGO-FET 生物传感器的
大肠杆菌 O157:H7检测性能
(a)实时检测培养的大肠杆菌O157:H7。(b)大肠杆菌O157:H7浓度梯度下的归一化电流响应。(c) rGO-FET 生物传感器的特异性。(d) rGO-FET生物传感器的稳定性。（对于b–d中的测试，n = 3）。
图4a显示了rGO-FET生物传感器对培养的大肠杆菌O157:H7的实时监测。加入大肠杆菌O157:H7后Ids立即升高，检测大肠杆菌O157:H7后加入PBS空白溶液后又立即降低。随着大肠杆菌O157:H7浓度的增加，Ids逐渐增加。rGO-FET生物传感器可以在46s内完成检测。在1.4–1.4×107 CFU mL−1范围内，大肠杆菌O157:H7的浓度与归一化电流响应呈线性关系（图4b）。rGO-FET生物传感器可以检测低至1.4 CFU mL−1的大肠杆菌O157:H7，这比目前报道的方法有显着优势，在低浓度病原微生物样品的检测中发挥了重要作用。
rGO-FET生物传感器对大肠杆菌O157:H7的归一化电流响应约为0.03，而其他微生物的归一化电流响应小于0.004，差异约为一个数量级（图4c）。根据t检验结果，p < 0.01，表明大肠杆菌O157:H7与其他微生物的检测结果存在显着性差异。根据Hill图，计算得到解离常数（Kd）为0.94 mL CFU−1。较低的Kd值使抗大肠杆菌O157:H7抗体与目标微生物的强烈结合。未修饰的rGO-FET传感器和用抗大肠杆菌O157:H7抗体修饰的rGO-FET生物传感器在4°C储存30天后的电流损失率分别约为8%和15%（图4d）。RSD%值分别为5.1%和9.8%，表明传感器能够在一个月内保持相对稳定。
图5 (a)检测真实水样中的大肠杆菌；(b)大肠杆菌O157:H7不同检测技术的比较。
为了测试rGO-FET生物传感器的实际应用，随机选取了几种与人类生活密切相关的水样，无需预处理即可直接检测病原微生物。如图5a所示，瓶装饮用水、净水器饮用水和自来水的归一化电流响应均低于0.004，根据特异性结果可判断为阴性（图4c）。结果还表明，样品中使用的饮用水和自来水的微生物指标均达到要求的标准（低于CFU 100 mL−1）。冲厕前和冲厕后水样的归一化电流响应分别为0.0838 ± 0.0084和0.0548 ± 0.0048，表明厕所污水样本中含有较多的病原微生物。工业废水、河水1和河水2的归一化电流响应分别为0.0174±0.0060、0.02786±0.0006和0.01615±0.0005。检测结果的RSD%值均小于5%。并且与培养法相比，根据t检验，t值均小于|t|Critical,2 = 4.30，表明分析结果不存在显着的系统误差。结果表明，在实际样品中存在较多干扰物种的情况下，rGO-FET生物传感器仍能有效检测目标病原微生物。
与其他技术相比，rGO-FET生物传感器可以在更短的时间内检测到更广泛的病原微生物（图5b）。此外，与其他已开发的用于大肠杆菌O157:H7检测的生物传感器相比，rGO-FET生物传感器也具有显著优势。最重要的是，rGO-FET生物传感器无需预处理即可直接检测真实样品，这对于现场实时检测至关重要。
文章结论
采用原位热还原法成功制备了rGO-FET传感器。表面功能化的 rGO-FET生物传感器可以在46 s内检测到低至1.4 CFU mL−1的大肠杆菌O157:H7。rGO-FET生物传感器具有良好的特异性和稳定性。最重要的是，rGO-FET生物传感器可以直接检测真实样品中的病原微生物，无需任何预处理。因此，rGO-FET生物传感器可以快速检测环境中的病原微生物，避免病原微生物的广泛传播，防止公共卫生事件的发生。