第一作者：马金标 (天津大学）

              蒋冠羽 (天津大学)

其他作者：马晴晴 (山东省公共卫生临床中心)

              王浩 (天津科技大学)

              杜漫漫 (天津大学)

              王灿* (天津大学)

              谢新武* (军事科学院)

              李铁(中国科学院)

              陈世兴 (中国科学院)

DOI：10.1039/D1AN02104D

期刊名称：Analyst

图文摘要

生物传感器检测系统可以通过收集呼出气冷凝液快速完成空气样本的检测，大大缩短诊断结核的时间

研究背景

由空气传播的结核分枝杆菌（MTB）感染引起的结核病（TB）严重威胁着人类健康。目前的检测技术并不能满足实际TB样本检测的要求，往往需要繁琐的检测步骤，既耗时又不灵活。作为一种常用的非侵入性采样方法，空气样本相比于痰液血液及尿液样本具有杂质含量低的特点。已有研究证实空气中含有可培养的MTB，因此空气样本被认为是一种有前景的检测TB的策略。然而空气样本中TB的检测仍然面临很多挑战。

文章亮点

1、开发了多通道微流控芯片并进行流体仿真提高了传感器的样品输送及切换能力。

2、开发了生物传感器检测系统提高了传感器的集成能力和抗干扰能力。

3、优化了呼出气冷凝采集条件并进行微生物活性测试评价采样效果。

4、实现结核模拟呼出气及气溶胶样本的快速灵敏检测。

文章摘要

本研究开发了一种多通道微流控芯片，并与超灵敏的硅纳米线场效应晶体管（SiNW-FET）生物传感器封装在一起。通过模拟对流体系统进行测试和优化确定最佳工况：流速为0.3 mL/min；垂直于硅纳米线的流动方向。将单向阀、切换阀和蠕动泵集成，建立生物传感器检测系统，实现TB样本的自动检测。然后系统阐述了影响模拟呼出气冷凝液（SEBC）采集的因素，并从采集量和生物活性的角度建立和优化了SEBC的采集方法。最佳采集条件为 0 °C， 5 mm 管径。仅需 2 分钟即可获得足够的样品量用于后续检测。然后进一步评价所建立的采集方法的实际应用价值，招募志愿者采用该方法采集呼出气冷凝液并分析采集效果。系统检测到的 MTB SEBC 显示出良好的灵敏度（~4 × 10⁴ 个颗粒/mL）。该系统有望在未来进一步集成化和小型化，以实现空气样本的即时便携检测。

图文总结

图1. 微流控芯片生物传感器的设计与集成

使用 SOLIDWORKS 软件设计并使用激光雕刻机蚀刻透明塑料聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）材质微流控芯片。PMMA材料具有良好的透光率，可以肉眼观察液路系统的进样情况。多通道微流控管道组合后的示意图和实物图可参考图1(d)。图1(e)显示了多通道微流控芯片的详细结构，包括多通道管上芯片、微流控腔中芯片和SiNW-FET生物传感器下芯片。上层芯片包含8个微管，外置单向阀使微管七进一出，保证流体系统单向流动，无交叉污染。

多通道微流控芯片生物传感器的检测原理如图1(f)所示。首先，将TB特异性物质Ag85B抗体固定在生物传感器表面，通过冷凝收集的方法将来自MTB的空气中的蛋白质转化为液体样品。然后将待测液体样品注入微流控芯片，通过上芯片和中芯片的通道流向微流控腔。样品在整个检测过程中保持动态流动，极大地提高了生物分析能力。当含有靶标（MTB Ag85B蛋白）的TB样品进入微流控腔时，固定有探针（MTB Ag85B抗体）的生物传感器表面将发生特异性结合。SiNW-FET生物传感器可对生物结合产生的微小电信号灵敏响应从而完成检测。

图2.生物传感器检测系统检测空气样本示意图

整个生物传感器检测系统流程如图2所示。将蠕动泵连接到样品采集装置，实现实时进样。然后将蠕动泵与多通道切换阀连接，实现多通道液路选择。然后连接一个单向阀，防止液路回流，确保样品不被污染。然后连接封装好的多通道微流控芯片，连接电化学检测设备和信号显示装置，完成自动化多通道微流控生物传感器检测系统的搭建。根据实验要求，每个样品可以顺序进样或同时进样。

图3. 呼出气冷凝收集方法的建立与优化

 SEBC整体采集参数优化流程如图3所示。如图3(a)所示，随着气管内径的增大，呼出气溶胶的采集量逐渐减小。当风管内径从 2 mm 增加到 8 mm 时，10 min 的收集效果下降 20%。在一定流量下，气体流量与管径的平方成反比。随着气溶胶流速的增加，增长率逐渐降低。这可能是由于流速的增加每单位时间带来更多的气溶胶颗粒，但减少了气溶胶在冷凝管中的停留时间。此外，较大的流速会带走或蒸发一些已冷凝的小液滴。此外，还应考虑受试者的实际经验，这与管道阻力直接相关。过大的摩擦阻力不利于受试者采用顺畅的嘴呼吸方法进行 SEBC 采集。综合来看，我们选择了内径5mm的硅胶气管进行研究应用

如图3(b)所示，以0℃为分离温度，当引入相同体积的气溶胶时，在-10℃、-5℃的冷凝条件下，SEBC体积无显着差异和 0°C。5 °C 和 10 °C 冷凝条件下的 SEBC 收集效果分别比 -10 °C 至 0 °C 的平均水平低 13% 和 30%。根据液膜破裂假说，冷凝收集过程中传热的相界面温差主要由零度液滴和呼出的热气提供。因此，在实际应用中选择0℃作为冷凝温度可以节约能源，实现更好的SEBC收集效率。

图4. 招募志愿者采集样本验证采集效果

接下来对空气样本采集效果进行测试。招募志愿者收集的呼出气冷凝液（EBC），并记录他们在 10 分钟内的呼气量和 EBC 采集量。将他们呼出的气溶胶体积-EBC体积与拟合曲线进行比较的结果如图4（a）所示。相应呼出气溶胶体积下采集的EBC在理论计算值0.2 mL的误差范围内稳定波动。说明本实验建立的气溶胶体积流量-EBC体积模型具有良好的实际应用价值。在实际应用中，可以根据需要的EBC量合理控制采集时间。对于微流控分析检测，只需 2 分钟即可获得 175μL 的足够样品量。

最后，我们使用流式细胞仪分析了 10 名志愿者的 EBC 生物活性，如图 4(b) 所示。志愿者 EBC 中活细胞的中位数比例约为 80%。冷凝收集法可以更好地保持呼吸道内微生物形态，并能保证后续生物检测的准确性，这意味着EBC冷凝收集法的系统误差小，冷凝收集过程中活细胞的损伤率稳定可满足要求。综上所述，EBC冷凝收集方法易于重复，在后续测试中具有良好的实际应用价值。

图5. 液路系统的流体仿真

样品流量的控制是微流控集成生物传感器和提高生物分析能力的关键。因此有必要对微流控芯片的流速参数进行仿真模拟。使用 COMSOL 软件在理想条件下模拟单通道流体系统。如图5(a)所示，流体系统中的流线和速度分布基本可以满足自动采样的要求。然后我们使用 0.1 mL/min、0.3 mL/min、0.6 ml/min 三种流速来测试流体系统的最佳工况。具体正视图见图5(b)、(c)、(d)，俯视图见图5(e)、(f)、(g)。可以看出流速分布在0.1mL/min条件下最为稳定，但流速过低对蠕动泵精度要求高，进样速度慢不利于快速检测。当0.6 mL/min条件下流速分布不均匀，可能会造成湍流破坏生物大分子，影响特异性检测。0.3mL/min条件下的液路系统最稳定，能满足使用要求。因此，我们选择 0.3 mL/min 作为进样流速。

SiNW存在于六角凹槽的切线上，其悬浮微结构决定了液体的流动方向，对其流体参数的分布有很大的影响。基于 0.3 mL/min 的入口流速，我们模拟了溶液相对于 SiNW 的流动方向对液体路径参数分布的影响。图 5(h)、(i)、(j)、(k) 是流向平行于 SiNW 的模拟。图 5(l)、(m)、(n)、(o) 是流向垂直于 SiNW 的模拟。与平行于SiNW方向的流动方向相比，可以看出，当垂直于SiNW方向时，液体在坑内仍保持流动，有利于生物特异性识别。同时，由于没有死体积，这种流动方向可以在切换样品时快速改变SiNW周围的溶液，从而缩短生物传感器的响应时间。因此，我们选择垂直于 SiNW 的样品流向。

图6. 空气样本的测试

为了对该系统进行测试，使用六喷嘴 Collison 喷雾器（BGI CN31l）在 7.6 bar 的压力下对 MTB Ag85B 蛋白进行气溶胶发生，并连接了高压空气过滤器以过滤其他杂质。光学粒度光谱仪 (TSI 3330) 用于测试本研究中的粒度分布，其空气动力学直径集中在0.3μm～4.16μm之间，浓度为4×104个粒子/mL，可用于模拟高浓度EBC。首先，进行患者呼气模拟，将雾化器的出口连接到EBC收集器BioscreenII以收集SEBC，并在0°C下收集10分钟。它通过蠕动泵以0.3 mL/min的控制流速连续传输到微流控芯片，并连接到信号采集系统进行检测。PBS缓冲液和10 ng/mL MTB Ag85B蛋白气溶胶挥发检测结果见图6(a)。目前的反应可以很好地区分 PBS 缓冲液和 TB 模拟呼出气。证明该系统可以实现对SEBC的灵敏响应。同时，我们探索了模拟环境气溶胶，为TB聚集点高浓度的气溶胶提供预警。结果如图 6(b) 所示。电流响应可以很好地区分PBS缓冲液和TB模拟环境气溶胶。证明该系统能够实现对环境气溶胶样品的灵敏响应。

如图6(c)所示，我们对上述数据进行归一化处理，可以看出自动微流控检测系统可以实现对环境空气样本的初步测量，并表现出良好的灵敏度（>0.1）。与 EBC 相比，生物气溶胶数据具有更大的误差棒。进行这种分析的原因可能是生物气溶胶采样由于其旋风收集原理，更容易将空气环境中的杂质收集到样品中。相关气溶胶样品和SEBC样品经传统方法ELISA定性验证，数值分别为24.98 pg/mL和32.93 pg/mL。系统检测到的信号与上述数值呈正相关，符合数量关系，有望实现空气样品的初步定量检测。虽然需要更多数据来确认在实际空气样本测试中使用这种生物传感器的可行性，但我们无疑提出了一个可以应用于TB患者的快速初步筛查的新思路。

文章结论

在这项研究中，我们设计并制造了一种多通道微流控芯片以连接超灵敏的 SiNW-FET 生物传感器。对流体系统进行了模拟，获得 0.3 mL/min 流速和垂直于 SiNW 的流动方向的最佳注入条件。结合单向阀、切换阀和蠕动泵，集成了用于TB实际样本的生物传感器检测系统。该系统可减少人为操作造成的误差，减少样品数量，无需专业人员即可完成检测。验证微生物在5 mm管径和0 ℃冷凝温度的最佳空气样品采集条件下仍保持良好的活性。对于微流控检测，只需 2 分钟即可获得足够的样品量。该系统可以检测MTB中蛋白质的SEBC（~4×104颗粒/mL），验证了微流控系统的可行性。该微流控装置不仅可用于实际TB样本的检测，还可用于其他空气传播病原菌的检测。该方法为直接快速检测微流控芯片上的其他病原体提供了有效的方法，也为传染病传播的预警提供了可能。同时，微流控芯片还提供了自动化或与现有分析系统集成的可能性。